Valoración de Hemoglobina (HbA,c) y la constante de unión de glucosa en pacientes diabéticos

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REYNALDO EMILIO-POLO L.. PhD “»

LEOBARDO SUAREZ R.,

BLANCA MARIA LARA S.<¹>

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INTRODUCCION S

En loi úlilraoi do* decenios, han aparecido en la literatura estudio* orímladoi a ntiUrcrr cuál n el significado real d* tas fraccione! menores de la hemoglobina en la valoración de la* perturbaciones del metabolismo, de loa carbohidrato* en el organlmo y cuál es el mecanismo filológico de la compensación de éste parámetro clínico en enfermos diabéticos.*

La eiectroforesis en i aminas de acetato de celulosa a pH por encima de 7.4 permite la separación de hemoglobinas presentes en una muestra de sangre en un Individuo adulto. El patrón electroforético más frecuente en nuestro medio es aquel en el cual apareen como bandas principales, las cormpon dienta a las hemoglobinas A.F.S y A,⁷. La* bandas que se obtienen por éste método electroforético co-nvipond cada una. a una mezcla de proteinaa

Estas se pueden separar teniendo en cuenta otras de sus propiedades fisicoquímicas, para Hlo es necesario emplear método* con un mayur índice de resolución. Técnica* modernas como el isoelectroenfoqus permiten la ob tención de laa denominada* fracciones menores de la hemoglobina, gnipo ai cual pertenece la HbA} e. 9^U* ⁿ forma mas aceptable de una variedad fJucoaáJads de la hemoglobina.*

Debido a la importancia clínica que tiene la HbAi_c, se han normalizado métodos croma tográticos y colorimétricos, para medir los niveles sanguíneos de esta fracción proteica. Esta importancia está relacionada con e. hecho de que el proceso de glucosilación de la hemoglobina, tiene que ver con los niveles de glucosa sanguínea presentes en el individuo durante los 2—3 meses previos a la determinación de HbAi_c, es decir, durante el período de vida de eritrocito¹. Se ha encontrado que en enfermos de diabetes insulino-dependiente no controlada el valor para este parámetro clínico es de 8.44 1 1.12, mientras que en los diabéticos de tipo II no contratados el nivel sanguíneo es de 6.29 ± 0.G6. Además de ésto se ha demostrado que una buena compensación de la diabetes sacarínica produce una disminución de los niveles de HbAi_c independientemente del carácter de la terapia, hasta alcanzar un valor de 3.94 ± 0.13⁵ Esto ha permitido establecer que la medición de este parámetro se puede emplear como criterio para valorar el estado de gravedad en que se encuentra un paciente diabético. Por esta razón, este parámetro de valoración se introdujo en los establecimientos de sanidad en varios países.⁸

Se ha encontrado niveles máximos de HbAj_c en pacientes diábeticos con infecciones de diversa etiología y en estado eetoacidótico grave, según parece, la formación excesiva de HbAi_c es una respuesta del organismo a la hipergli-cemia y no depende de las particularidades genéticas de algunas clases de diabetes⁴ . El fortalecimiento del proceso de glucosilación tiene como fin disminuir los niveles de glucosa sanguínea libre en un proceso de carácter compensatorio.

El establecimiento de la probabilidad de la glucosilación de la HbA permitió suponer que la glucosa puede unirse con otro tipo de proteínas sanguíneas. Esto ha permitido introducir nuevos métodos para el diagnóstico y tratamiento de la diabetes sacarínica y actualmente en los servicios de salud de muchos países se emplea como parámetro, la determinación cuantitativa de proteínas séricas que tienen afinidad por la glucosa.³

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A comienzos de la última década un grupo de investigadores búlgaros introdujo un nuevo concepto que permite valorar el estado meta-bólico de la glucosa en un individuo. Este parámetro mide la relación que hay entre los niveles totales de glucosa sanguínea y la glucosa unida a proteínas. Ha sido demostrado que este coeficiente es constante para cada individuo y por ello este parámetro se denomina LA CONSTANTE DE UNION DE GLUCOSA En individuos sanos, con poca predisposición a la diabetes, este coeficiente tiene un valor por debajo de 4.5, mientras que los diabéticos y las personas con alta predisponibilidad a esta enfermedad tienen una constante por encima de este valor.

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Con el fin de introducir en nuestro país métodos más confiables para la valoración del estado patológico de diabéticos, se normalizaron técnicas para la determinación cuantitativa de HbAi_c y para el cálculo de la constante de unión de glucosa en el laboratorio de Bioquímica de la Facultad de Ciencias de la Salud de la Universidad Surcolombiana.

MATERIALES Y METODOS

Se estudió un pequeño grupo de 18 pacientes pertenecientes a la Asociación Hullense de Diabéticos. El grupo estuvo conformado por individuos residentes en la ciudad de Neiva. En su mayoría eran mujeres que presentaron cuadros clínicos de diabetes sacarínica no insu lino dependiente. Aproximadamente la mitad del grupo presentó complicaciones de diversa etiología como se observa en la Tabla 1.

Para la determinación de HbAi_c se empleó sangre ox al atada y la cuantificación se hizo por un método coloñmétrico, el cual se basa en la propiedad que tiene el 5-hidroximetifurfural de formar un complejo coloreado con el ácido tíobarbitúrico. La absorbancia medida a 443 ■ nm. para este complejo, está directamente relacionada con los niveles sanguíneos de la forma

cetoamínica estable de la hemoglobina glucosi-

*    lada denominada HbAi_c².

Los pasos que se siguieron paia el análisis cuantitativo de HbA^_c fueron los siguientes:

A.    Preparación del hemolizado

B.    Diálisis

C.    Hidrólisis

D.    Sedimentación de proteínas con ácido trictoro—acético

G. Formación del complejo coloreado con ácido tlobarbitúrico

F. Determinación de la absorbancla a 443 nm.

Para la determinación de la constante de unión de glucosa se estudió la interacción entre la glucosa sanguínea y una cantidad de glucosa agregada a una muestra de sangre in vitro de acuerdo con un método empleado en Bulgaria^. Para ello un volumen de sangre venosa oxala-tada se dividió en tres volúmenes Iguales y cada fracción se colocó en un frasco de penicilina de 10 cc previamente numerado que contenía un volumen de anticoagulantes. En el frasco 2 se vertió un volumen de solución de glucosa de concentración conocida. Posteriormente los tres » frascos se incubaron en un baño de agua a 37° C durante una hora. Pasado este tiempo se sedimentaron las proteínas con ácido tricloroacé-tico. De cada frasco se tomó una cantidad igual de sobrenadantes y al obtenido del frasco No. 3 le agregamos una cantidad de glucosa iguai a la adicionada al frasco 2 antes de la incubación a 37° C. Posteriormente se determinó colarimé-tricamente con el reactivo de 0—toiuidina los niveles de glucosa en cada sobrenadante. Todo el procedimiento hasta aquí descrito aparece esquematizado en la Figura 1.

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RESULTADOS Y DISCUSION '

Los resultados obtenidos para los parámetros estudiados aparecen en la Tabla 1. Como puede verse en este cuadro, los valores de HbAic oscilaron entre 2.9°/o y 11. 15⁰ai y los de la constante de unión de glucosa entre 1.55 y 10.9.

El análisis de las muestras indicó que el 82°'o de las personas estudiadas tuvieron una hemoglobina glucosilada por encima de 3.84 ±

0.13 y el 47°¡o tuvieron una constante de unión ^ de glucosa por debajo de 4.5. Tres de los pacientes estudiados tuvieron niveles de HbAj_c dentro del rango normal, de los cuales dos te-

37° C. I

Determinación Colimétrica _fe-Qlucosa_

Cálculo de la Constante de Union

Fig I Esquema general del procedimiento empleado para la valoración de la Constante de Union de Glucosa

nían una constante de afinidad por debajo de 4.5. Debido a que la HbAi_c es un índice de control diabético, se pude decir que los tres pacientes tienen una deabetes controlada, aunque (P.L) tiene más tendencia a mantener niveles de glucosa, por lo tanto su predisposición a ser hiperglucémlco es mayor que las otras dos personas y por ende el control terapc-ucico para ella debe ser más estricto.

De 11 pacientes que tenían niveles de HbAic elevados tan sólo 5 presentaron una constante de afinidad por debajo de 4.5, esto confirma la idea generalizada relacionada con el hallazgo en la clínica, de personas con alta predisposición a la enfermedad y de individuos con poca predisponibllldad a ella.

Para analizar mas detalladamente los resultados obtenidos en este trabajo, ps necesario aclarar el significado de la constante según el esquema de la Figura 1; la determinación en el primer frasco señala los niveles de glucosa sanguínea en el paciente. En el segundo frasco se determinan los niveles de glucosa sanguínea después que una cantidad de ésta es agregada a la sangre, que parte de ella se une con proteínas sanguíneas y después que éstas ton separadas por sedimentación con ácido tricloroacético. El contenido del frasco 2 se empleó para la de terminación de glucosa activa después de una hora de sobrecarga con esta sustancia.

En el tercer frasco se cuantificó la glucosa sanguínea después de incubación, separación de proteínas y postenor sobrecarga con glucosa, es decir, se determinó la glucosa total sin la acción de proteínas sanguíneas. La glucosa activa o unida a proteínas se valoró cuantificando la diferencia de loi niveles de glucosa entre las pruebas segunda y tercera. Como se deduce en

i.-sta técnica hay sólo una unión mecánica entre la glucosa y un grupo de proteínas sanguíneas, las cuales por gozar de esta propiedad han sido denominadas proteínas glucosofílicas. Ha sido propuesto que estas proteínas juegan un papel importante como amortiguadores, no permitiendo variaciones bruscas en la concentración de glucosa sanguínea y de esta forma dismi nuyen “el esfuerzo” del aparato insulínico preservándolo asi de su “agotamiento". Según parece algunas participan en procesos enzimá-tizados de degradación de glucosa, aunque ellas en sí no son enzimas.

En los diabéticos estudiados por nosotros el 53°/o tuvo un coeficiente por debajo de 4. B, tres pacientes con complicaciones diversas tuvieron valores por encima de 5. En un 57°/o de los pacientes en los cuales se midieron los dos parámetros, observamos una Quena correlación entre los niveles de HbAi_c y el valor de la constante.

Los resultados obtenidos en nuestro trabajo, difícilmente nos permiten establecer si hay dependencia entre la clínica y ia gravedad de la enfermedad y el valor de la constante de unión de glucosa, pero las variaciones en los valores di² este nuevo parámetro, nos lleva a concluir que existen factores complementarios de riesgo de complicaciones en los diabéticos que tienen que ver con el mecanismo fisiológico de las denominadas proteínas glucosofílicas.

Los datos experimentales obtenidos por nosotros, nos permiten recomendar la deter minación de HbA_lp en nuestro país en la prai tica clínico--diagnostica de danos funcionales, que tienen que ver con el metabolismo de ios carbohidratos en nuestro organismo, con el Tin de valorar la gravedad de la enfermedad y para controlarla adecuadamente con una terapia efectiva. De los métodos existentes para medir este parámetro clínico recomendamos el colo rimétrico, normalizado por nosotros, el cual tiene las ventajas siguientes: es un método de alta sensibilidad, rápido, ei complejo coloreado que se obtiene es muy estable y, lo más importante de todo, es que es un método muy económico y de alta reproducibilidad.

Debido a la muestra tan pequeña y las malas condiciones infra—estructurales de nuestro laboratorio, no podemos hacer generalizaciones relacionadas con la constante de unión de glu cosa, simplemente queremos recomendar hacer estudios adicionales, con grandes poblaciones, relacionados con el valor clínico—diagnóstico de las variaciones de este parámetro propuesto por otros grupos de investigación. Por ello consideramos importante introducir esta medición en los establecimientos de Banidad en Colombia, con el fin de hacer estudios estadísticos que muestren qué tipo de dependencia hay entre la clínica, la gravedad de la diabetes sacarínica y el valor de este coeficiente.

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GLOSARIO DE TERMINOS

E LECTROFORE5I5. Técnica empleada en Investigación médica para sepuar compuestos presentes en líquidos biológicos por medio de un campo eléctrico.

ESTADO CETOACIDOTICO. Estado crítico, en el cual adem&s de aumentar la acidez hay un incremento en los niveles de cuervos cetónicos en la sangre.

FORMA CETOAMINICA DE LA HEMOGLOBINA. Forma estable de U hemoglobina Aj_c que se emplea en medicina para determinar el estado glicémico en Que se ha encontrado un Individuo durante 2-3 meses antes de su cuantificacIAn.

H b A i e. Siglas que se emplean en medicina para denotar una variedad de la hemoglobina denominada GLUCOSILADA, debido a su gran afinidad por la glucosa. También se le representa como gHb.

PROTEINAS SERICAS. Hace referencia a las proteínas presentes en el suero sanguíneo.

SANGRE OXALATADA. Sangre mezclada con oialato de amonio, el cual se emplea como antlcoagulante.

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   • • L neneiads en Enlsrmeris, Departamento ds Enfsrawria, Facidtad da Ciencias ds la Salud.

Universidad Surcolomfcane. Nmi Colombia

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" " BIBLIOGRAFIA

lBUM HF. Gabbay KH. Gallop PM. Setene? 1978. 200; 21—27.