Detección y cuantificación de virus dengue 2 en lisado celular y plasma de niños por qPCR en tiempo real usando un estuche comercial y el equipo EcoTM System-Illumina
##plugins.themes.bootstrap3.article.sidebar##
PDF
FLIP
HTML
##plugins.themes.bootstrap3.article.main##
Métodos para diagnóstico de dengue virus (DENV) en zonas endémicas son altamente necesarios. Uno de ellos es la reacción en cadena de polimerasa en tiempo real (qPCR), método que permite además la cuantificación del genoma viral. Los estuches comerciales de qPCR para DENV son costosos y restringen su uso a un número pequeño de dispositivos de qPCR, limitando la aplicación de la técnica. Aquí se evaluó el desempeño de un estuche comercial de qPCR para la detección de DENV-2 en un dispositivo de qPCR (EcoTM System, Illumina) localmente disponible, no listado por el fabricante del estuche. Lisado de células VERO-76 y plasma de niños, ambos con infección confirmada por DENV-2, fueron evaluados. Como controles de especificidad, lisado celular y plasma de niños infectados con DENV-1, además de lisado no infectado, fueron también incluidos. Las reacciones fueron además evaluadas simultáneamente en un equipo Applied Biosystem 7300, uno de los recomendados por el fabricante del estuche. La curva estándar generada por el EcoTM fue robusta (R2= 0.99), con baja variabilidad en las réplicas (<10%). La eficiencia de la reacción fue buena (88.8%) y sólo hubo amplificación en los lisados y plasma de niños infectados con DENV-2. Hubo una fuerte correlación positiva (R2= 1.0, P=0.0028) entre el número de copias de ARN viral en las muestras detectadas por los dos dispositivos de qPCR usados. Así, el uso del estuche para detección de DENV-2 aquí probado puede extenderse al EcoTM de forma segura. Este trabajo fortalece la capacidad tecnológica para el estudio de DENV en un área endémica.
Descargas
##plugins.themes.bootstrap3.article.details##
Bhatt S, Gething PW, Brady OJ, et al. The global distribution and burden of dengue. Nature. 2013;496(7446):504-7.
SIVIGILA. Casos por evento en departamento y municipios. Instituto Nacional de Salud, 2012.
Rothman AL. Dengue: defining protective versus pathologic immunity. The Journal of clinical investigation. 2004;113(7):946-51.
Simmons CP, Farrar JJ, Nguyen v V, Wills B. Dengue. The New England journal of medicine. 2012;366(15):1423-32
Lanciotti RS, Calisher CH, Gubler DJ, Chang GJ, Vorndam AV. Rapid detection and typing of dengue viruses from clinical samples by using reverse transcriptase-polymerase chain reaction. Journal of clinical microbiology. 1992;30(3):545-51.
Bustin SA. Absolute quantification of mRNA using realtime reverse transcription polymerase chain reaction assays. Journal of molecular endocrinology. 2000;25(2):169-93.
Wong ML, Medrano JF. Real-time PCR for mRNA quantitation. BioTechniques. 2005;39(1):75-85.
Heid CA, Stevens J, Livak KJ, Williams PM. Real time quantitative PCR. Genome research. 1996;6(10): 986-94.
Gurukumar KR, Priyadarshini D, Patil JA, et al. Development of real time PCR for detection and quantitation of Dengue Viruses. Virology journal.2009;6:10.
Dos Santos HW, Poloni TR, Souza KP, et al. A simple one-step real-time RT-PCR for diagnosis of dengue virus infection. Journal of medical virology. 2008;80(8):1426-33.
Chien LJ, Liao TL, Shu PY, Huang JH, Gubler DJ, Chang GJ. Development of real-time reverse transcriptase PCR assays to detect and serotype dengue viruses. Journal of clinical microbiology. 2006;44(4):1295-304.
Sadon N, Delers A, Jarman RG, et al. A new quantitative RT-PCR method for sensitive detection of dengue virus in serum samples. Journal of virological methods. 2008;153(1):1-6.
Laue T, Emmerich P, Schmitz H. Detection of dengue virus RNA in patients after primary or secondary dengue infection by using the TaqMan automated amplification system. Journal of clinical microbiology. 1999; 37(8):2543-7.
De Paula SO, de Melo Lima C, Torres MP, Pereira MR, Lopes da Fonseca BA. One-Step RT-PCR protocols improve the rate of dengue diagnosis compared to Two-Step RT-PCR approaches. Journal of clinical virology: the official publication of the Pan American Society for Clinical Virology. 2004;30(4):297-301.
Mishra B, Sharma M, Pujhari SK, Appannanavar SB, Ratho RK. Clinical applicability of single-tube multiplex reverse-transcriptase PCR in dengue virus diagnosis and serotyping. Journal of clinical laboratory analysis. 2011;25(2):76-8.
Callahan JD, Wu SJ, Dion-Schultz A, et al. Development and evaluation of serotype- and group-specific fluorogenic reverse transcriptase PCR (TaqMan) assays for dengue virus. Journal of clinical microbiology. 2001;39(11):4119-24.
Ito M, Takasaki T, Yamada K, Nerome R, Tajima S, Kurane I. Development and evaluation of fluorogenic TaqMan reverse transcriptase PCR assays for detection of dengue virus types 1 to 4. Journal of clinical microbiology. 2004;42(12):5935-7.
Centers for Disease Control and Prevention. DENV-1-4 real-time RT-PCR assay for detection and serotype identification of dengue virus. CDC package insert. Catalog no. KK0128. Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta, GA.
Santiago GA, Vergne E, Quiles Y, et al. Analytical and clinical performance of the CDC real time RT-PCR assay for detection and typing of dengue virus. PLoS neglected tropical diseases. 2013;7(7):e2311.
Waggoner JJ, Abeynayake J, Sahoo MK, et al. Development of an internally controlled real-time reverse transcriptase PCR assay for pan-dengue virus detection and comparison of four molecular dengue virus detection assays. Journal of clinical microbiology. 2013; 51(7):2172-81.
Waggoner JJ, Abeynayake J, Sahoo MK, et al. Single-reaction, multiplex, real-time rt-PCR for the detection, quantitation, and serotyping of dengue viruses. PLoS neglected tropical diseases. 2013;7(4):e2116.
Levi JE, Tateno AF, Machado AF, et al. Evaluation of a commercial real-time PCR kit for detection of dengue virus in samples collected during an outbreak in Goiania, Central Brazil, in 2005. Journal of clinical microbiology. 2007;45(6):1893-7.
Harris E, Roberts TG, Smith L, et al. Typing of dengue viruses in clinical specimens and mosquitoes by single-tube multiplex reverse transcriptase PCR. Journal of clinical microbiology. 1998;36(9):2634-9.
Shanghai ZJ Bio-Tech Co., Ltd. Dengue Virus General-Type Real Time RT-PCR Kit. Catalog ER-0063-04. Shanghai ZJ Bio-Tech Co.
Kong YY, Thay CH, Tin TC, Devi S. Rapid detection, serotyping and quantitation of dengue viruses by TaqMan real-time one-step RT-PCR. Journal of virological methods. 2006;138(1-2):123-30.
Nolan T, Hands RE, Bustin SA. Quantification of mRNA using real-time RT-PCR. Nature protocols.2006;1(3):1559-82.
Van Guilder HD, Vrana KE, Freeman WM. Twenty-five years of quantitative PCR for gene expression analysis. BioTechniques. 2008;44(5):619-26.
Duyen HT, Ngoc TV, Ha do T, et al. Kinetics of plasma viremia and soluble nonstructural protein 1 concen-trations in dengue: differential effects according to serotype and immune status. The Journal of infectious diseases. 2011;203(9):1292-300.
Tricou V, Vu HT, Quynh NV, et al. Comparison of two dengue NS1 rapid tests for sensitivity, specificity and relationship to viraemia and antibody responses. BMC infectious diseases. 2010;10:142.
Waggoner JJ, Abeynayake J, Sahoo MK, et al. Comparison of the FDA-approved CDC DENV-1-4 real-time reverse transcription-PCR with a laboratory-developed assay for dengue virus detection and serotyping. Journal of clinical microbiology. 2013;51(10):3418-20.
